Actina

Actina
Actina G (código PDB 1j6z). Mostrando no sítio ativo as moléculas de ADP e o cátion bivalente.
Indicadores
Símbolo	Actin
Pfam	PF00022
InterPro	IPR004000
PROSITE	PDOC00340
SCOP	2btf
Estruturas PDB disponíveis: PDB 1atn actina de Oryctolagus cuniculus

As actinas são uma família de proteínas globulares que formam os microfilamentos, um dos três componentes fundamentais do citoesqueleto das células dos organismos eucariotas. A actina pode ser encontrada como monómero em forma livre, denominada actina G, ou formando parte de polímeros lineares denominados microfilamentos ou actina F, que são essenciais para funções celulares tão importantes como a mobilidade e a contração da célula durante a divisão celular. Em vertebrados, identificaram-se três grandes grupos de isoformas da actina, chamadas alfa, beta e gama. As alfa encontram-se nos tecidos musculares, e são um dos constituintes principais do aparato contrátil do músculo. As beta e as gama coexistem na maior parte dos tipos celulares como componentes do citoesqueleto, e como mediadores da mobilidade celular interna.

A importância da actina reflete-se na elevada percentagem que esta proteína representa no conteúdo proteico total da célula e em que a sua sequência está muito conservada, ou seja, que mudou muito pouco ao longo da evolução, pelo que se pode dizer que a sua estrutura foi otimizada. Apresenta duas características peculiares: é um enzima que hidrolisa ATP, a molécula energética biológica, e fá-lo de maneira muito lenta, e além disso é a proteína que estabelece mais interações com outras proteínas de todas as conhecidas, o que lhe permite realizar as mais variadas funções, que afetam quase todos os aspetos da vida celular. A miosina é um exemplo de proteína que se une à actina. Outro exemplo é a vilina, que pode entrelaçar a actina em feixes ou cortar os filamentos de actina, dependendo da concentração do catião cálcio no meio.

A actina, ao formar microfilamentos num processo dinâmico, proporciona uma estrutura de suporte que dá à célula a possibilidade de remodelar a sua forma rapidamente em resposta ao seu meio ou a sinais enviados pelo organismo, por exemplo, aumentando a superfície celular para a absorção ou dando suporte à adesão das células para formar tecidos. Sobre esta estrutura de suporte podem ancorar-se outros enzimas, organelos como os cílios, e dirigir a deformação da membrana plasmática para permitir a endocitose ou a citocinese. Também pode produzir movimento, por ela mesma ou ajudada por motores moleculares. Desse modo, contribui para processos como o transporte intracelular de vesículas e organelos e para a contração muscular, ou a migração celular, importante no desenvolvimento embrionário, na cura de feridas ou na invasividade do cancro. A origem evolutiva desta proteína pode ser rastreada nas células procariotas, nas quais existem equivalentes. Por último, é importante no controlo da expressão génica.

Há muitas doenças que têm a sua base em alterações genéticas em alelos dos genes encarregados da produção de actina ou das suas proteínas associadas, e é também essencial no processo de infeção de alguns microorganismos patógenos. As mutações nos distintos genes de actina presentes em humanos ocasionam miopatias, variações no tamanho e na função cardíaca e surdez. Os componentes do citoesqueleto também têm relação com a patogenicidade de bactérias intracelulares e virus, especialmente em processos relacionados com a evasão da resposta do sistema imunitário. Já foram identificadas seis diferentes isoformas de actina, entre elas a Actina alfa 1, músculo esquelético, também conhecida como ACTA1.

Estrutura

A actina é uma das proteínas mais abundantes nos eucariotas e está presente por todo o citoplasma. Nas fibras musculares representa 20% em peso da proteína celular total e, noutras células animais, oscila entre 1 e 5%. Porém, não existe um único tipo de actina, senão que os seus genes codificantes formam uma família multigénica (família que, em plantas, compreende mais de 60 elementos, entre genes e pseudogenes e, em humanos, mais de 30). Isto significa que a informação genética de cada indivíduo possui instruções para gerar variantes da actina (denominadas isoformas) que possuirão funções ligeiramente distintas. Deste modo, os organismos eucariotas expressam distintos genes que dão lugar: à actina α, que se encontra em estruturas contráteis; à actina β, no bordo em expansão das células que empregam a projeção de estruturas celulares como método de mobilidade; e à actina γ, nos filamentos das fibras de stress. Para além das similitudes existentes entre as isoformas de um organismo, também existe uma conservação evolutiva no que respeita à estrutura e função entre organismos do domínio eucariota, e mesmo em bactérias, nas quais se conhece o homólogo MreB, uma proteína que pode polimerizar-se em microfilamentos, e em arqueias, nas quais existe um representante (Ta0583) ainda mais semelhante às actinas de eucariotas.

A actina apresenta-se na célula em duas formas: como monómeros globulares denominados actina G e como polímeros filamentosos denominados actina F (que são filamentos compostos de muitos monómeros de actina G). A actina F pode denominar-se também microfilamento. A cada filamento de actina une-se uma molécula de adenosina trifosfato (ATP) ou de adenosina difosfato (ADP), que por sua vez está associada a um catião Mg²⁺. Das distintas combinações possíveis entre as formas de actina e o nucleótido trifosfato, na célula predominam a actina G-ATP e a actina F-ADP.

Actina G

No que respeita à sua estrutura molecular, a actina G possui uma aparência globular vista com o microscópio eletrónico de varrimento; não obstante, por cristalografia de raios X pode apreciar-se que está composta por dois lóbulos separados por uma fenda; a estrutura conforme o pregamento ATPase (dobramento), um centro de catálise enzimática ao qual pode unir-se o ATP e Mg²⁺ e pode hidrolisar o ATP a ADP e fosfato. Este pregamento é um motivo estrutural conservado que também está presente noutras proteínas que interagem com nucleosídeos trifosfato como a hexoquinase (uma enzima do metabolismo energético) ou as proteínas Hsp70 (uma família de proteínas que contribuem para que outras proteínas possuam estruturas funcionais). A actina G só é funcional quando possui ADP ou ATP na sua fenda; porém, na célula predomina o estado unido a ATP quando a actina está livre.

Modelo molecular de fitas da actina de músculo esquelético de coelho segundo Graceffa e Domínguez, 2003. Salientaram-se os quatro subdomínios, assim como os extremos N e C-terminal e o lugar de união do ATP. A molécula está orientada segundo a convenção que se adota normalmente, pelo que fica na parte superior o extremo - (ponta de flecha) e na inferior o extremo + (barbado).

A actina cristalizada por Kabsch, que é a mais utilizada como modelo em estudos estruturais, porque foi a primeira que se purificou, procede do músculo esquelético do coelho. Tem dimensões aproximadas de 67 x 40 x 37 Å, uma massa molecular de 41785 Da e um ponto isoelétrico estimado de 4,8. A sua carga líquida em pH 7 é de -7.

Estrutura primária

A sequência de aminoácidos completa deste tipo de actina foi determinada por Elzinga e colaboradores em 1973, e afinada em trabalhos posteriores do mesmo autor. Contém 374 resíduos de aminoácidos. O seu extremo N-terminal é muito ácido. Começa com um aspartato acetilado no seu grupo amino, enquanto o seu C-terminal é básico, formado por uma fenilalanina precedida por uma cisteína de certa importância funcional. Ambos os extremos se situam numa posição muito próxima dentro do subdomínio I. Apresenta também alguns aminoácidos anómalos, como uma N^τ-metil-histidina em posição 73.

Estrutura terciária-domínios

Está formada por dois domínios conhecidos como grande e pequeno, separados por uma fenda que leva no seu centro o lugar para a união do ATP-ADP+P_i. Por debaixo deste existe uma greta de menor profundidade chamada "sulco". Quando estão na sua forma nativa, apesar dos seus nomes, ambos os domínios têm um tamanho similar.,

Nos estudos topológicos, por convenção, a proteína orienta-se de maneira que o domínio maior fica à esquerda, enquanto o menor se situa à direita. Nesta posição, o domínio pequeno divide-se por sua vez no subdomínio I (posição inferior, resíduos 1-32, 70-144 e 338-374) e subdomínio II (posição superior, resíduos 33-69). O domínio maior também se divide noutros dois, o subdomínio III (inferior, resíduos 145-180 e 270-337) e o subdomínio IV (superior, resíduos 181-269). A zona exposta dos subdomínios I e III denomina-se extremo "barbado", enquanto à dos subdomínios II e IV se lhe chama extremo "em ponta de flecha". Esta denominação faz referência ao facto de que devido à pequena massa do subdomínio 2, a actina adquire polaridade, que se discutirá posteriormente ao falar da dinâmica de ensamblagem. Alguns autores nomeiam os subdomínios como Ia, Ib, IIa e IIb, respetivamente.

Outras estruturas notáveis

• A estrutura superssecundária mais notável é uma folha beta de cinco cadeias que se compõem de um meandro β e uma unidade β-α β dextrogira. Está presente em ambos os domínios. Isto sugere que a proteína surgiu por duplicação génica.
• O lugar de união para o nucleótido de adenosina está entre duas estruturas em forma de gancho beta pertencentes aos domínios 1 e 3. Os resíduos implicados são Asp11-Lys18 e Asp154-His161, respetivamente.
• Justo debaixo do nucleótido encontra-se o lugar de união para o catião divalente, que in vivo é com maior probabilidade o Mg²⁺ ou o Ca²⁺ enquanto que in vitro é o formado por uma estrutura quelante na qual contribuem a Lys18 e dois oxigénios dos fosfatos α e β do nucleótido. Este cálcio está coordenado com seis moléculas de água que se encontram retidas pelos aminoácidos Asp11, Asp154, e Gln137. Juntamente com o nucleótido forma um complexo que restringe os movimentos de uma região chamada dobradiça, situada entre os resíduos 137 e 144, mantendo desta maneira a forma nativa da proteína, até ao ponto de que a sua retirada desnatura o monómero de actina. Esta região também é importante, porque determina as conformações "aberta" ou "fechada" da fenda da proteína.
• Quase com segurança existem também pelo menos outros três centros com menor afinidade (intermédia) e outros de baixa afinidade para catiões divalentes. Especulou-se sobre o papel destes centros na polimerização da actina na fase de activação.
• No subdomínio 2 existe uma estrutura, chamada alça-D ou D-loop devido a que se une à DNase I, situada entre os resíduos His40 e Gly48 que aparece como um elemento desordenado na maioria dos cristais e como uma folha β quando está formando complexo com a DNase I. Segundo Domínguez et al., o episódio chave da polimerização seria a propagação de uma alteração conformacional desde o centro de união para o nucleótido até este domínio, que passaria de ser de uma alça para uma hélice. Esta teoria parece ser refutada por outros trabalhos.

Actina F

Actina F; representação da superfície de uma repetição de 13 subunidades baseada no modelo de Ken Holmes do filamento de actina (ver microfilamento).

A descrição clássica da actina F indica que tem uma estrutura filamentosa interpretável como uma hélice levógira monocatenária com um giro de 166º e aumento de 27,5 Å ou bem como uma hélice dextrogira bicatenária com meio passo de rosca de 350-380 Å, e cada actina está rodeada doutras quatro. A simetria do polímero de actina, que é de umas 2,17 subunidades por volta de hélice é incompatível com a formação de cristais, que só é possível quando estas são exatamente 2, 3, 4 ou 6 subunidades por volta. Portanto, devem ser realizados modelos interpretando dados procedentes de técnicas que superam estes inconvenientes, como a microscopia eletrónica, a criomicroscopia eletrónica, cristais de dímeros em distintas posições ou difração de raios X. Na realidade, falar de uma "estrutura" não é correto para algo tão dinâmico como um filamento de actina, pelo que seria melhor falar de distintos estados estruturais, entre os quais o dado mais constante é o aumento de 27,5 Å, enquanto que a rotação das subunidades mostra uma considerável variabilidade, sendo normal observar deslocamentos de até 10% da sua posição ideal. Algumas proteínas, como a cofilina, parecem aumentar o ângulo de giro, mas, novamente, pode interpretar-se que, em lugar disso, estabilizam alguns "estados estruturais" normais. Estes poderiam ser importantes no processo de polimerização.

As medidas do raio de giro ou espessura do filamento são mais controversas: enquanto os primeiros modelos lhe atribuíam uma longitude de 25 Å, dados atuais de difração de raios X e de criomicroscopia eletrónica coincidem numa medida de uns 23,7 Å. Estes mesmos estudos determinaram com bastante precisão os pontos de contacto entre monómeros. Uns estabelecem-se com unidades da mesma cadeia, entre o extremo "barbado" de um monómero e o extremo "em ponta de flecha" do seguinte, enquanto que os monómeros de cadeias adjacentes fazem contacto lateralmente por meio de projeções do subdomínio 4, e as mais importantes são a formada pelo C-terminal e um enlace hidrofóbico formado por três corpos nos quais intervêm os resíduos 39-42, 201-203 e 286. Para fazerem parte de um filamento, segundo este modelo, os monómeros estariam numa configuração chamada "plana", na qual os subdomínios giram entre si, e que também parece encontrar-se no homólogo bacteriano da actina MreB.

Dado que todas as subunidades de um microfilamento apontam para o mesmo extremo, diz-se que o polímero apresenta polaridade na sua estrutura. Este facto dá lugar a uma convenção consistente em nomear o extremo que possui uma subunidade de actina que expõe o lugar pelo qual une ATP ao meio como «extremo (-)», enquanto que o cabo oposto, no qual a fenda está dirigida a outro monómero adjacente, é o «extremo (+)». A denominação «em ponta de flecha» e «barbado» dos extremos dos microfilamentos deve-se ao seu aspeto vistos com microscopia eletrónica de transmissão quando se processam mediante uma técnica denominada «decoração». Este método consiste na adição de elementos S1 da miosina a tecidos fixados com ácido tânico; esta miosina une-se de forma polar aos monómeros de actina, o que dá lugar a uma configuração semelhante a flechas com plumas ao longo de todo o seu fuste, onde o fuste corresponderia à actina e as plumas à miosina. Deste modo, o extremo do microfilamento que fica sem miosina a sobressair interpreta-se como a ponta da flecha, e o extremo oposto denomina-se barbado.

No músculo, o filamento helicoidal da actina F contém também uma molécula de tropomiosina, uma proteína de uma longitude de 40 nanómetros que se enrola ao redor da hélice de actina F. Durante o estado de repouso celular, a tropomiosina recobre os sítios ativos da actina de modo que não pode produzir-se a interação actina-miosina que origina a contração muscular. Unidas ao longo do filamento de tropomiosina há outras moléculas proteicas, as troponinas, complexos de três polímeros: troponina I, troponina T e troponina C.

Pregamento

Modelo de fitas obtido aplicando o programa PyMOL aos dados cristalográficos da prefoldina da arqueia Pyrococcus horikoshii. Podem ver-se as seis estruturas superssecundárias em forma de hélice enrolada "pendurando" dos barris β centrais. Na literatura costuma-se compará-las aos tentáculos de uma medusa. Vista ao microscópio eletrónico, a prefoldina de eucariotas tem uma estrutura muito similar.

A actina pode adquirir espontaneamente uma grande parte da sua estrutura terciária. Porém mostra um comportamento muito especial e quase único na forma em que adquire a sua forma plenamente funcional a partir da sua forma nativa recentemente sintetizada. A razão da existência de uma rota tão especial poderia ser a necessidade de evitar a presença de monómeros de actina mal pregados, que seriam tóxicos, porque poderiam atuar como terminadores inadequados da polimerização. Em qualquer caso, é chave para a estabilidade do citoesqueleto, e até poderia ser um processo essencial para a coordenação do ciclo celular.

Para assegurar o correto pregamento emprega um tipo de chaperonina (proteína que ajuda outras a pregarem-se) citosólica do grupo II, chamada CCT, formada por um duplo anel de oito subunidades diferentes (heterooctamérica) que se distingue das demais chaperonas moleculares, e em especial da sua homóloga em arqueias GroEL, em que não precisa de uma co-chaperona que atue como tampa sobre a cavidade central catalítica. Aceita substratos unindo-se a eles por meio de domínios específicos, pelo que em princípio se pensou que era exclusiva da actina e tubulina, ainda que atualmente se comprovou por imunoprecipitação que pelo menos interage com um grande número de polipéptidos, que possivelmente funcionam como substratos. Atua mediante alterações conformacionais dependentes de ATP, e em ocasiões são necessárias várias rodadas de libertação e catálise para que complete o seu trabalho.

Para o seu correto pregamento, a actina e a tubulina também necessitam especificamente da colaboração doutra proteína, a prefoldina, um complexo heterohexamérico (formado por seis subunidades distintas), que interagem tão especificamente que se crê que coevoluíram. No caso da actina, esta proteína une-se imediatamente a ela enquanto ainda se está a traduzir, aproximadamente quando tem uma longitude de 145 aminoácidos, que são os correspondentes ao domínio N-terminal.

São usadas subunidades de reconhecimento diferentes para a actina e a tubulina, ainda que sobrepostas. Provavelmente no caso da actina trata-se das subunidades PFD3 e PFD4 que se unem à actina em dois lugares, o I, entre os resíduos 60–79, e o II, entre os resíduos 170–198. A actina reconhece, carrega e entrega à CCT em conformação aberta pela parte interna do extremo dos "tentáculos" da prefoldina (ver imagem e nota de rodapé). O contacto quando se entrega a actina é tão breve que não se chega a formar um complexo ternário, libertando-se a prefoldina imediatamente.

Modelo molecular de fitas do domínio γ apical da chaperonina CCT.

Posteriormente, a chaperonina citosólica (CCT) realiza o pregamento da actina de forma sequencial, e formando uniões com as subunidades, em vez de simplesmente a encerrar na sua cavidade. Para isso possui zonas específicas de reconhecimento no seu domínio β apical. A primeira etapa do pregamento consistiria no reconhecimento dos resíduos 245-249. Posteriormente, estabeleceriam contacto outros determinantes. Tanto a actina como a tubulina se unem à CCT em conformações abertas na ausência de ATP. No caso da actina, em cada alteração conformacional une-se a duas subunidades, diferentemente da tubulina, que o faz a quatro. A actina tem sequências de união específicas, interagindo com as subunidades CCTδ e β ou bem com CCTδ e CCTε. Após a união de AMP-PNP à CCT, os substratos vão movendo-se pela cavidade da chaperonina. Parece ser também que no caso da actina é necessária a atuação da proteína CAP como um possível cofactor nos estádios finais do pregamento da actina.

Ainda não se conhece com exatidão a regulação deste processo, mas sabe-se que a proteína PhLP3 (proteína semelhante à fosducina) regula a sua atividade inibindo-a, por meio da formação de um complexo ternário.

Mecanismo catalítico da ATPase

A actina é uma ATPase, ou seja, um enzima que hidrolisa ATP. Este conjunto de enzimas caracteriza-se por atuar com extrema lentidão. Esta ATPase "ativa-se", ou o que é o mesmo, a sua velocidade aumenta umas 40.000 vezes quando a actina faz parte de um filamento. Um valor de referência para esta taxa de hidrólise sob certas condições ideais seria 0,3 s^-1. Posteriormente, o P_i permaneceria muito tempo unido à actina juntamente ao ADP, libertando-se perto do extremo do filamento.

Pelo momento não se conhecem os detalhes moleculares do mecanismo catalítico. Mas, ainda que exista muita polémica a este respeito, parece claro que para a hidrólise do ATP é necessário que a proteína tenha uma conformação "fechada", e crê-se que aproxima à distância adequada os resíduos implicados. Um dos resíduos chave seria o Glu137, situado no subdomínio 1. A sua função seria ancorar a molécula de água que realiza um ataque nucleofílico ao enlace do fosfato γ do ATP, enquanto o nucleótido se une fortemente aos subdomínios 3 e 4. A lentidão do processo catalítico dever-se-ia à grande distância e posição enviesada desta molécula de água em relação ao seu reagente. Com muita probabilidade, a alteração conformacional que se produz por rotação de domínios entre as formas G e F da actina aproxima o Glu137, permitindo a sua hidrólise. Segundo este modelo, a polimerização e a função ATPase estariam desacopladas num primeiro momento.

Genética

A actina é uma das proteínas mais conservadas ao longo da evolução porque interage com um grande número de proteínas. Há 80,2% de conservação de sequência a nível de gene entre a de Homo sapiens e a da levedura Saccharomyces cerevisiae, e 95% de conservação da estrutura primária do produto proteico.

Ainda que a maioria dos leveduras tenha só um gene para a actina, os eucariotas superiores, em geral, expressam várias isoformas de actina codificadas por uma família de genes relacionados. Os mamíferos têm pelo menos seis genes de isoformas de actina codificadas em genes separados, que se dividem em três classes (alfa, beta e gama) segundo os seus pontos isoelétricos. Em geral, as actinas alfa encontram-se no músculo (α-esquelética, α-liso aórtico, α-cardíaca, e γ2-liso entérico), enquanto que as isoformas beta e gama são abundantes em células não musculares (β- e γ1-citoplasmáticas). Embora as sequências de aminoácidos e as propriedades in vitro das isoformas sejam muito similares, estas isoformas não podem substituir-se completamente umas por outras in vivo.

O gene típico de actina tem aproximadamente um 5'-UTR de uns 100 nucleótidos, uma região traduzida de 1200 nucleótidos, e um 3'-UTR de 200 nucleótidos. A maioria dos genes de actina estão interrompidos por intrões, e têm até seis intrões em 19 possíveis localizações bem caracterizadas. A grande conservação da família faz com que a actina seja o modelo favorito para realizar estudos que comparem modelos de intrões precoces e tardios da evolução dos intrões.

Todos os procariotas não esféricos parecem possuir genes como o MreB, que codificam homólogos da actina; estes genes são necessários para a manutenção da forma da célula. O gene ParM derivado de um plásmido codifica uma proteína similar à actina cuja forma polimerizada é instável dinamicamente, e parece intervir para repartir o ADN do plásmido entre as células filhas durante a divisão celular por um mecanismo análogo ao empregado pelos microtúbulos durante a mitose eucariótica.

Dinâmica de acoplamento

Mecanismo de polimerização da actina G a actina F; note-se a hidrólise do ATP

A actina F combina as qualidades de ser resistente e dinâmica. Ao contrário de outros polímeros, como o ADN, que mantêm unidos os seus elementos constitutivos mediante ligações covalentes, nos filamentos de actina os monómeros montam-se por meio de ligações mais fracas de tipo não covalente. Isto, que em princípio debilita a estrutura, porque poderia romper por agitação térmica, é resolvido graças ao estabelecimento de ligações laterais com os monómeros vizinhos. Ao mesmo tempo, as ligações fracas têm a vantagem de que os extremos do filamento podem libertar ou incorporar facilmente monómeros, de maneira que se podem remodelar rapidamente e mudar a estrutura celular da qual são responsáveis em resposta a estímulos ambientais. Este último juntamente com o mecanismo bioquímico pelo qual se efetua é o que se conhece como "dinâmica de montagem".

Nucleação e polimerização

A polimerização e despolimerização da actina é necessária para a quimiotaxia e a citocinese. São necessários fatores nucleantes para estimular a polimerização da actina. Um desses fatores nucleantes é o complexo Arp2/3, que imita o dímero de actina G para estimular a nucleação (ou formação do primeiro trímero) de actina G monomérica. O complexo Arp2/3 une-se aos filamentos de actina com um ângulo de 70º para formar novos ramos de actina nos filamentos de actina existentes. Além disso, aos filamentos de actina une-se ATP, e a hidrólise deste ATP estimula a desestabilização do polímero.

O crescimento dos filamentos de actina pode ser regulado pelas proteínas timosina e profilina. A timosina une-se à actina G para amortecer o processo de polimerização, enquanto a profilina se une à actina G para trocar ADP por ATP, promovendo a adição monomérica ao extremo barbado (+) dos filamentos de actina F.

Estudos in vitro

Os estudos da dinâmica de adição e perda de subunidades dos microfilamentos foram realizados in vitro (quer dizer, no laboratório, fora de sistemas celulares) devido a que o polímero de actina resultante dá lugar à mesma actina F produzida in vivo, onde este processo está controlado por muitas proteínas para responder às necessidades celulares, de modo que seria muito difícil observar as suas condições básicas. In vitro, este facto produz-se de forma sequencial: primeiro, dá-se uma «fase de ativação», na qual a união e troca de catiões divalentes em lugares específicos da actina G, unidos a ATP, produzem uma mudança conformacional, conhecida às vezes como Actina G* ou monómero de actina F, porque é mais parecida às unidades que se situam no filamento. Isto prepara-a para a seguinte «fase de nucleação», na qual a actina G dá lugar a pequenos fragmentos instáveis de actina F com capacidade de polimerizar. Inicialmente, formam-se dímeros e trímeros de maneira instável. Quando o número destes é grande o suficiente, tem lugar a «fase de alongamento», na qual o filamento se forma e cresce rapidamente por adição reversível de novos monómeros a ambos os extremos. Finalmente, no «equilíbrio estacionário», os monómeros de actina G trocam-se nos extremos do microfilamento sem que varie o comprimento total do polímero. Nesta última fase define-se a «concentração crítica C_c» como a relação entre as constantes de montagem e desmontagem (trata-se, pois, de uma constante de dissociação), e representa a concentração de actina G na qual a dinâmica de adição e eliminação de monómeros não produz uma modificação no comprimento do microfilamento. Nas condições usuais in vitro, C_c é 0,1 μM, o que significa que a valores maiores se dá uma polimerização e a valores menores, uma despolimerização.

Papel da hidrólise do ATP

Um assunto importante que se introduziu no apartado anterior é o facto de que, embora a actina hidrolize ATP, tudo parece indicar que isto não intervém na montagem, porque, por uma parte, a hidrólise se produz em grande medida no interior do filamento, e por outra, o ADP também pode polimerizar. Isto formula a questão de compreender qual é o processo termodinamicamente desfavorável que requer um gasto de energia tão enorme. O chamado "ciclo da actina", que liga a hidrólise à polimerização, consiste na adição de monómeros de Actina G-ATP preferentemente na extremidade farpada, criando um fluxo de monómeros para o extremo em ponta de flecha no que se conhece como "tapete rolante" (treadmilling, em inglês), onde os monómeros estariam em forma de Actina F-ADP e seriam libertados, trocando posteriormente este ADP por ATP e fechando desse modo o ciclo.

Pouco depois da adição, produz-se a hidrólise do ATP de forma relativamente rápida. Existem duas hipóteses sobre como se produz, a estocástica, na qual a hidrólise se produziria ao acaso influída em certo modo pelas moléculas vizinhas, e a vetorial, na qual só se produziria no limite com outras moléculas que já hidrolisaram o seu ATP. Em qualquer caso, não se liberta o P_i resultante, senão que permanece um tempo unido não covalentemente à actina-ADP, de maneira que num filamento existiriam três espécies de actina: ATP-Actina, ADP+P_i-Actina e ADP-Actina. O conteúdo de um filamento em cada uma destas espécies depende do seu comprimento e estado: ao começo do alongamento, o filamento tem uma composição aproximadamente equivalente de monómeros com ATP e ADP+P_i e só uma pequena quantidade junto ao extremo (-) de actina-ADP. À medida que se alcança o estado estacionário, a situação inverte-se, e a maior parte do filamento está com ADP e só a zona perto do extremo (+) contém ADP+P_i, enquanto que o ATP está reduzido ao extremo. Se compararmos os filamentos de actina-ADP puros com aqueles que incorporam ATP, nos primeiros as constantes críticas são similares em ambos os extremos, enquanto que nos outros dois nucleótidos a C_c é diferente: No extremo (+) Cc⁺=0,1 μM, enquanto que no extremo (-) Cc^-=0,8 μM, com o qual se dão as seguintes situações:

Para concentrações de actina G-ATP menores que Cc⁺ não se produz o alongamento do filamento.

Para concentrações de actina G-ATP menores que Cc^- mas maiores que Cc⁺ o alongamento dá-se no extremo (+).

Para concentrações de actina G-ATP maiores que Cc^- o microfilamento cresce em ambos os extremos.

Portanto, pode-se deduzir que a energia da hidrólise se utiliza para criar um verdadeiro "estado estacionário", quer dizer, criar um fluxo em vez de um simples equilíbrio, o que dota o filamento de dinamismo, polaridade e força de tração, o que justifica o gasto pela ganância de funções biológicas essenciais. Além disso, as proteínas que se unem à actina que controlam este dinamismo detetam a configuração dos distintos tipos de monómeros, como se verá na próxima secção.

Nos estereocílios parece existir uma exceção na forma de acoplamento típica dos microfilamentos mediante tapete rolante (treadmilling). Neste caso, o controlo do tamanho da estrutura seria totalmente apical e de alguma maneira controlada pela expressão génica, ou seja, pela quantidade total de monómero de proteína sintetizada num dado momento.

Proteínas associadas

Complexo actina (verde) - profilina (azul). A profilina mostrada pertence ao grupo II, presente caracteristicamente em rins e encéfalo.

In vivo, o citoesqueleto de actina não é composto exclusivamente de actina, senão que para a sua geração, permanência e função requer outras proteínas; estas denominam-se proteínas de união a la actina ou proteínas que se unem à actina (ABP, actin binding proteins) e intervêm na sua polimerização e despolimerização, estabilidade, organização em feixes ou redes, e na sua fragmentação e destruição. A diversidade destas proteínas é tão grande, que se considera que a actina é a proteína que participa no maior número de interações proteína-proteína de todas as conhecidas. Por exemplo, existem elementos que sequestram a actina G, impedindo a sua incorporação aos microfilamentos. De igual maneira, existem proteínas que estimulam a sua polimerização ou que dotam de complexidade às redes em síntese. Entre elas estão:

A timosina β4 é uma proteína de 5 kDa que se pode unir à actina G-ATP com uma estequiometria de 1:1; isto quer dizer que uma unidade de timosina β4 se une a outra de actina G, nesta proporção. O seu papel é impedir a incorporação dos monómeros ao polímero em crescimento.

A profilina, uma proteína citosólica de 15 kDa que também se une com estequiometria 1:1 aos monómeros de actina G-ATP, mas que tem uma função distinta: facilita a troca de nucleótidos de ATP por ADP. Além disso, está envolvida noutras funções celulares, como a união de repetições de Pro noutras proteínas ou de lípidos que atuam como segundos mensageiros.

A proteína gelsolina, coadjuvante na montagem e desmontagem da actina. Possui seis subdomínios, chamados S1-S6. Cada um possui cinco lâminas β flanqueadas por duas hélices α, uma das quais está situada perpendicularmente às lâminas β e outra em posição paralela. O extremo N-terminal (S1-S3) forma uma folha β, tal como o C-terminal (S4-S6).

Outras proteínas que se unem à actina regulam o comprimento dos microfilamentos realizando cortes neles, o que dá lugar a novos extremos ativos para a polimerização. Portanto, se um microfilamento, que possui dois extremos aos quais podem unir-se ou dissociar-se monómeros, é cortado duas vezes, originam-se três novos microfilamentos com seis extremos; a nova situação favorece a dinâmica de montagem e desmontagem. Entre estas proteínas salientam a gelsolina e a cofilina. O corte é realizado primeiramente mediante mudanças na conformação do monómero de actina ao qual se unem no polímero, e depois ficam recobrindo o novo extremo (+) gerado, o que impede o agregado ou a troca de novas subunidades de actina G e, como os extremos (-) ficam sem recobrir, favorecem a despolimerização dos filamentos.

Outro tipo de proteínas que se unem à actina recobrem os extremos da actina F para os estabilizarem, mas sem capacidade de os romper. Exemplos destas proteínas são CapZ (que une os extremos (+) segundo os níveis de Ca²⁺/calmodulina da célula, níveis que dependem de sinais externos e internos da célula e que intervêm na regulação das suas funções biológicas) ou a tropomodulina (que se une aos extremos (-)). A tropomodulina é essencial como estabilizador da actina F presente nas miofibrilas dos sarcómeros do músculo, estruturas caracterizadas pela sua grande estabilidade.

Estrutura atómica da Arp2/3. Cada cor corresponde a uma subunidade: Arp3, laranja; Arp2, azul marinho (as subunidades 1 e 2 não se mostram); p40, verde; p34, azul claro; p20, azul escuro; p21, magenta; p16, amarelo.

O complexo Arp2/3 está amplamente difundido em todos os organismos eucariotas. É composto por sete subunidades, algumas das quais possuem uma topologia claramente relacionada com a sua função biológica: duas das suas subunidades, denominadas «ARP2» e «ARP3», possuem uma estrutura muito semelhante à dos próprios monómeros de actina. Esta homologia permite a ambas as unidades comportarem-se como agentes nucleantes da polimerização dos monómeros de actina G a actina F. Além disso, este complexo é necessário para estabelecer estruturas dendríticas e em anastomose (bifurcadas ou em rede), e, portanto, mais complexas, de actina F.

Inibidores químicos

Estrutura química da faloidina.

Existem várias toxinas que interferem com a dinâmica das actinas, tanto despolimerizando-as (latrunculina e citocalasina D) como estabilizando-as (faloidina):

A latrunculina, uma toxina produzida por poríferos, une-se à actina G impedindo a sua união aos microfilamentos.

A citocalasina D, um alcaloide produzido por fungos, une-se ao extremo (+) da actina F impedindo a adição de novos monómeros. Descreveram-se os efeitos da citocalasina D, mediados pela alteração da dinâmica de actinas, na atividade de p53 (em animais) ou em respostas gravitrópicas (em plantas).

A faloidina, uma toxina isolada do fungo Amanita phalloides, une-se à interface existente entre os monómeros de actina adjacentes do polímero de actina F, o que evita a despolimerização da actina F.

Funções e Localização

A proteína actina encontra-se tanto no citoplasma como no núcleo celular. A sua localização está regulada pelas vias de transdução de sinais que integram os estímulos que a célula recebe e que permitem a reestruturação das redes de actina em resposta a eles. Em Dictyostelium, intervém a rota dos fosfoinosítidos mediada pela fosfolipase D. Os filamentos de actina são especialmente abundantes e estáveis nas fibras musculares. Dentro do sarcómero (a unidade morfológica e fisiológica das fibras musculares) a actina dispõe-se formando as bandas I e A; nestas últimas, apresenta-se conjuntamente com a miosina.

Citoesqueleto

Micrografia de fluorescência que mostra a actina F (em verde) em fibroblastos de rato.

Ver artigo principal: Microfilamento

Os microfilamentos intervêm no movimento de todas as células móveis, mesmo nas não musculares, porque se descreveu que os fármacos que desorganizam a actina F (como as citochalasinas) afetam a atividade de ditas células. A proteína actina supõe 2% do total de proteínas em hepatocitos, 10% em fibroblastos, 15% em amebas e até 50-80% em plaquetas ativadas. Existem distintos grupos de actina, com estrutura e funções ligeiramente distintas. A actina α é exclusiva das fibras musculares, e a actina presente noutras células costuma ser dos tipos β e γ. Além disso, a actina de tipos distintos ao α costuma ter uma alta taxa de renovação que provoca que a maior parte dela não faça parte de estruturas permanentes. Assim, os microfilamentos nas células não musculares aparecem de três formas:

• Redes de microfilamentos: Na célula animal é comum que sob a membrana plasmática se forme um córtex celular repleto de microfilamentos no qual não há organelos. Esta rede está em relação com abundantes recetores celulares que transduzem sinais do exterior da célula.
• Feixes de microfilamentos: Estes microfilamentos, dispostos em redes, são de maior comprimento e intervêm, em associação com proteínas contráteis como a miosina não muscular, no deslocamento de substâncias a nível intracelular.
• Anéis de actina periódicos: Esta é uma estrutura especializada encontrada nos axónios. Trata-se de uma organização periódica constituída por anéis de actina uniformemente espaçados. Nesta estrutura, os anéis, juntamente com tetrâmeros de espectrina que ligam os anéis vizinhos, formam um citoesqueleto coeso que sustenta a membrana axonal. A periodicidade desta estrutura (com intervalos de aproximadamente 190 nm) pode também regular a distribuição dos canais de sódio nos axónios.

Leveduras

Em leveduras, o citoesqueleto de actina é chave durante os processos de endocitose, citocinese, determinação da polaridade celular e durante a morfogénese. Estes processos, além de depender da actina, implicam 20 ou 30 proteínas associadas, muito conservadas evolutivamente, junto com multidão de moléculas de sinalização; a combinação de todos estes elementos permite uma montagem modulada espacial e temporalmente que define a biologia celular em resposta a estímulos internos e externos.

Os leveduras possuem três grandes tipos de elementos produto da associação da actina: patches, cabos e anéis que, apesar de se detetarem durante longos períodos de tempo, veem-se submetidos a um equilíbrio dinâmico devido à contínua polimerização e despolimerização. Como proteínas acessórias, possuem uma cofilina/ADF de 16 kDa (codificada por um único gene, denominado COF1); o Aip1, um cofactor da cofilina que favorece a desmontagem dos microfilamentos; o Srv2/CAP, um regulador da dinâmica relacionado com proteínas adenilil ciclases; uma profilina de aproximadamente 14 kDa que se associa aos monómeros de actina; e a twinfilina, uma proteína de 40 kDa implicada na organização das estruturas tipo patch.

Plantas

Os estudos de genómica de plantas revelaram a existência de isovariantes proteicas dentro da família de genes da actina. Em Arabidopsis thaliana, uma dicotiledónea empregada como organismo modelo, existem pelo menos dez tipos de actinas, nove de α tubulinas, seis de β tubulinas, seis de profilinas e dezenas de miosinas. Tal diversidade explica-se pela necessidade evolutiva de possuir variantes ligeiramente diferentes na sua pauta de expressão temporal e espacial; porém, a maioria delas expressa-se conjuntamente nos tecidos analisados. O tramado de redes de actina distribui-se por todo o citoplasma das células cultivadas in vitro, com um reforço ao redor do núcleo que se conecta, mediante raios, ao córtex celular; dito tramado é muito dinâmico, experimentando uma contínua polimerização e despolimerização.

Estrutura do subdomínio C-terminal da vilina, uma proteína que pode excindir microfilamentos.

Ainda que as células vegetais possuam geralmente uma parede celular que define a sua morfologia e impede o seu movimento, os seus microfilamentos geram as forças necessárias para várias atividades celulares, por exemplo, as correntes citoplasmáticas geradas pelos microfilamentos e as miosinas. Além disso, a actina intervém no movimento de organelos e morfogénese celular, processos que incluem a divisão celular, o alongamento e a diferenciação.

Em relação às proteínas associadas ao citoesqueleto de actina presentes em plantas podem-se mencionar as seguintes: a vilina, uma proteína pertencente à família da gelsolina/severina, que pode cortar microfilamentos e unir monómeros de actina na presença do catião cálcio; a fimbrina, um elemento que pode reconhecer e unir monómeros de actina e que intervém na formação de tramados (mediante uma regulação diferente da que há em células animais e de leveduras); as forminas, proteínas que podem atuar como agentes nucleantes da polimerização da actina F; a miosina, típico motor molecular próprio de eucariotas que, em Arabidopsis thaliana, está codificado por 17 genes classificados em duas classes distintas; a CHUP1, com capacidade de unir actina e implicada na distribuição espacial dos cloroplastos na célula; a KAM1/MUR3, uma proteína que define a morfologia do complexo de Golgi e a composição em xiloglicanos da parede celular; a NtWLIM1, proteína que facilita a formação de estruturas com forma de novelo de actina; e a ERD10, que participa na associação entre organelos delimitados por membranas e os microfilamentos e que parece desempenhar um papel especialmente importante em condições de stresse.

Actina nuclear

A actina é essencial para a transcrição feita pelas ARN polimerases Pol I, Pol II e Pol III. Na transcrição feita por Pol I, a actina e a miosina (MYO1C, que se une ao ADN) atuam como motores moleculares. Para a transcrição feita por Pol II, é necessária β-actina para a formação do complexo de pré-iniciação. A Pol III contém β-actina como uma subunidade. A actina pode também ser um componente dos complexos de remodelação da cromatina e de partículas de pré-mRNP (formadas pelo pré-ARNm envolto em proteínas), e está implicada na exportação nuclear de ARNs e proteínas.

Contração muscular

Ver artigo principal: Contração muscular

Estrutura do sarcómero, estrutura morfológica e funcional do músculo esquelético da qual faz parte a actina.

No músculo, o filamento helicoidal da actina F contém também uma molécula de tropomiosina, que é uma proteína de um comprimento de 40 nanómetros que se enrola ao redor da hélice de actina F. Durante o estado de repouso celular, a tropomiosina recobre os sítios ativos da actina de modo que não se pode produzir a interação actina-miosina (esta interação dá lugar a um deslizamento entre ambos os filamentos que, por coordenação de muitas cópias destes elementos dispostos nos músculos, produz a sua contração). Unidas ao longo da fibra de tropomiosina há outras moléculas proteicas, as troponinas, complexos de três polímeros: troponina I, troponina T e troponina C. A função moduladora da tropomiosina depende da interação com a troponina na presença de iões de Ca²⁺.

A actina, juntamente com a miosina, intervém na contração e relaxamento dos músculos, e entre as duas representam 90% das proteínas musculares. O processo global é disparado mediante um sinal externo, tipicamente mediante um potencial de ação excitador do músculo que contém as células especializadas ricas em filamentos de actina e miosina. O ciclo de contração-relaxamento compreende os seguintes passos:

Despolarização do sarcolema e transmissão do potencial de ação através dos túbulos T.

Abertura de canais de Ca²⁺ do retículo sarcoplasmático.

Aumento da concentração citosólica de Ca²⁺ e interação destes catiões com a troponina causando uma modificação na sua conformação, o que por sua vez altera a estrutura da tropomiosina, que recobre o sítio ativo da actina, permitindo o estabelecimento das ligações cruzadas miosina-actina (esta última presente como filamentos delgados).

Movimento das cabeças de miosina sobre os filamentos delgados, tanto de forma independente como dependente de ATP. Este último mecanismo, mediado pela atividade ATPase das cabeças de miosina, provoca o movimento dos filamentos de actina em direção ao disco Z.

Captura do Ca²⁺ pelo retículo sarcoplasmático, que provoca uma nova mudança conformacional na tropomiosina, que inibe a interação actina-miosina.

Outros processos biológicos

O estudo clássico da função da actina circunscrevia-a à manutenção do citoesqueleto e, portanto, à organização e movimento dos organelos e determinação da forma celular. Porém, o papel da actina é bastante mais amplo na fisiologia celular eucariota; e mesmo existem elementos semelhantes em procariotas.

Citocinese. Nas células animais e de leveduras, a divisão celular costuma supor a separação de uma célula em duas células filhas mediante a constrição da sua zona equatorial. Neste processo intervém um anel contrátil de actina, miosina e α-actinina. Na levedura de fissão Schizosaccharomyces pombe, a actina se assemble ativamente no anel contrátil com a participação de Arp3, a formina Cdc12, profilina e WASp, mas também intervêm microfilamentos pré-formados. Uma vez constituído o anel, a estrutura se mantém numa contínua montagem/desmontagem que, com a ajuda do complexo Arp2/3 e das forminas, é um processo central da citocinese. O conjunto formado pelo anel contrátil, os microtúbulos do fuso acromático e o material denso periférico denomina-se «corpo de Fleming» ou «corpo intermédio».

Apoptose. Durante a morte celular programada, a família de proteases denominadas ICE/ced-3 (da família das proteases conversoras de interleucina-1β) degradam in vivo a actina em dois fragmentos de 15 kDa e 31 kDa, o que representa um dos mecanismos de destruição da viabilidade celular em que se baseia a apoptose. Também se observou esta destruição mediante a protease calpaína; e o emprego de inibidores da calpaína diminui a proteólise da actina e mesmo a degradação do ADN (outro dos eventos característicos da apoptose). Por outro lado, a indução do processo de apoptose por um stress passa pela reorganização do citoesqueleto de actina (o que implica também a sua polimerização), dando lugar às estruturas denominadas fibras de stress; isto é ativado pela via das MAP quinases.

Esquema de uma zonula occludens ou união estreita, um tipo de estrutura de união celular que coesiona os epitélios. A actina é um dos elementos das ancoragens mostrados em verde.

Adesão celular e desenvolvimento. A adesão entre células é um caráter dos organismos pluricelulares da qual depende a capacidade de especialização dos tecidos e, portanto, o aumento da complexidade dos mesmos. As uniões celulares dos epitélios empregam o citoesqueleto de actina, dentro de cada célula, e as caderinas, como elementos extracelulares, com uma conexão entre ambas mediada por cateninas. A interrupção da dinâmica das actinas repercute no desenvolvimento dos organismos; de facto, a actina é um elemento tão fundamental que, geralmente, os organismos dispõem de sistemas de genes redundantes. Por exemplo, os exemplares de Dictyostelium que foram privados do gene da α-actinina ou do fator gelificante não mostravam um fenótipo anómalo, possivelmente devido a que uma das proteínas podia realizar a função da outra; mas nos duplos mutantes, carentes de ambas, o desenvolvimento viu-se alterado.

Modulação da expressão génica. O estado de polimerização da actina influencia a pauta de expressão génica. Em 1997, em trabalhos feitos com células de Schwann detetou-se que a despolimerização mediada por citocalasina D provocava uma pauta de expressão peculiar dos genes implicados na mielinização deste tipo de célula nervosa. Nos organismos unicelulares, nalguma das suas fases vitais demonstrou-se que a actina F também modifica o transcriptoma no fungo Candida albicans. Além disso, proteínas semelhantes à actina desempenham um papel regulador durante a espermatogénese no rato e, em leveduras, propôs-se que proteínas semelhantes à actina exercem um papel na modulação epigenética. De facto, a actina juntamente com um tipo de miosina nuclear pode interagir com ARN polimerases e outros enzimas da maquinaria transcricional, e atuar como iniciador da transcrição.

Dinâmica de estereocílios. Alguns tipos de células desenvolvem na sua superfície umas finas evaginações filiformes com função mecanosensorial denominadas estereocílios. Por exemplo, estes organelos estão implicados no funcionamento do órgão de Corti do ouvido. Como característica principal, estas estruturas possuem um comprimento que pode ser modificado. Em relação à sua arquitetura molecular, os estereocílios apresentam um núcleo paracristalino de actina em equilíbrio dinâmico com os monómeros presentes no citosol adjacente. Ao longo deste núcleo dispõem-se miosinas dos tipos VI e VIIa, enquanto que a miosina XVa está situada nos seus extremos e em quantidades proporcionais ao comprimento do estereocílio.

Patologia molecular

Na maioria dos mamíferos existem seis genes diferentes para a actina. Dois deles estão relacionados com o citoesqueleto (ACTB e ACTG1) enquanto que os quatro restantes o estão com o músculo esquelético (ACTA1), músculo liso (ACTA2), músculo liso entérico (ACTG2) e com o músculo cardíaco (ACTC1). As mutações que afetam estes genes eram desconhecidas até 1998, e viu-se que produzem miopatias, variações no tamanho e a função cardíaca e surdez. Além disso, a actina do citoesqueleto está implicada no mecanismo de patogenicidade de muitos agentes infeciosos, entre eles o VIH. A imensa maioria das mutaçãos que afetam a actina são de tipo pontual e têm um efeito dominante, exceto pelo menos seis mutações de miopatia nemalínica. Isto deve-se a que em muitos casos a variedade mutante do monómero de actina atua como uma "tampa" que impede o alongamento da actina F.

Associada ao gene ACTA1

ACTA1 é o gene que codifica a isoforma α da actina humana, presente principalmente no músculo esquelético, e que também se expressa no músculo cardíaco e na glândula tiroide. A sua sequência consta de sete exãos, que produzem cinco transcritos conhecidos. Em 2006, o ENMC (European Neuromuscular Centre) tinha publicado 116 mutações relacionadas com patologias conhecidas como actinopatias. A maior parte delas consiste em substituições pontuais de aminoácidos, que em muitos casos podem ser associadas com o fenótipo que determina a gravidade e o curso da doença.

Bastões nemalínicos gigantes produzidos mediante a transfecção com uma sequência de ACTA1 portadora de uma mutação responsável pela miopatia nemalínica.

Manifestam-se alterando a estrutura e a função do músculo esquelético produzindo três formas de miopatia: miopatia nemalínica tipo 3, miopatia congénita com excesso de microfilamentos (CM) e miopatia congénita com desproporção de tipos de fibra (CFTDM). Também se detetaram mutações que produzem miopatias core (com zonas desprovidas de atividade oxidativa). Embora os seus fenótipos sejam similares, além da miopatia nemalínica típica e a de bastões intranucleares, alguns especialistas distinguem um tipo de miopatia, chamada actínica da miopatia nemalínica. Na primeira acumulam-se agregados de actina em vez dos típicos bastões. Um paciente pode mostrar mais de um destes fenótipos na biópsia. Os sintomas mais habituais consistem numa morfologia facial típica (fácies miopática), debilidade muscular e atraso no desenvolvimento motor e dificuldades respiratórias. O curso, a gravidade e a idade de aparecimento são muito variáveis, e encontram-se formas de miopatia sobrepostas. Na miopatia nemalínica aparecem umas estruturas não patognomónicas em diversas localizações das fibras musculares tipo 1 conhecidas como "bastões nemalínicos", com uma composição similar à dos discos Z do sarcómero.

A patogénese é muito variada. Muitas mutações dão-se na zona da fenda da actina, próximas ao local de união para os nucleótidos, enquanto que outras se dão no domínio 2, ou nas zonas de interação com as proteínas associadas, o que explica a grande variedade de agregados que se formam nestes casos, como corpos nemalínicos, intranucleares ou corpos zebra. Na miopatia nemalínica produzem-se mudanças no pregueamento e nas propriedades de agregação da actina, e também na expressão de outras proteínas associadas. Nalgumas variantes em que se encontram corpos intranucleares, a mudança no pregueamento oculta o sinal de exportação nuclear, de tal modo que a agregação da forma mutante de actina se produz no núcleo celular. Pelo contrário, parece que nas mutações de ACTA1 que dão lugar a CFTDM está mais afetada a função sarcomérica que a própria estrutura. Em trabalhos recentes tentou-se esclarecer o aparente paradoxo de que não exista uma correlação clara entre a abundância de bastões e a debilidade muscular. Parece ser que algumas mutações particulares podem induzir uma maior taxa de apoptose nas fibras musculares de tipo II.

Posição de sete mutações significativas das distintas actinopatias relacionadas com ACTA1.

No músculo liso

Existem duas isoformas que codificam actinas do músculo liso:

ACTG2 codifica a isoforma mais longa de actina, que tem nove exões, um deles, o situado na extremidade 5', que não é traduzido. Trata-se de uma γ actina que se expressa no músculo liso entérico. Não se encontraram mutações que correspondam a patologias neste gene, embora se tenha visto mediante microarrays que esta é a proteína que, com diferença, mais aumenta a sua expressão nos casos de resistência à quimioterapia com cisplatino.

ACTA2 codifica uma α actina localizada no músculo liso, e também no músculo liso vascular. A mutação MYH11 poderia ser responsável por pelo menos 14% dos casos de aneurismas de aorta torácica hereditários, concretamente o tipo 6, porque a variante mutada produz uma montagem incorreta dos filamentos e uma redução da capacidade de contração do músculo liso vascular. Nestes indivíduos observa-se uma degeneração aórtica medial, com áreas de desorganização e hiperplasia, e estenose dos vasa vasorum da aorta. O número de doenças nas quais se crê que este gene poderia estar implicado está em aumento. Foi relacionado com a doença de Moyamoya, e parece ser que algumas mutações em heterozigose poderiam predispor a muitas patologias vasculares, como o aneurisma de aorta torácica e a cardiopatia isquémica. A α-actina do músculo liso também é um interessante marcador para avaliar a progressão da cirrose hepática.

No músculo cardíaco

ACTC1 é o gene que codifica a isoforma da α actina presente no músculo cardíaco. Sequenciaram-no pela primeira vez Hamada e colaboradores em 1982, que comprovaram que estava interrompido por cinco intrãos. Foi o primeiro gene dos seis onde se encontraram alelos implicados em processos patológicos.

Secção de coração de rato que mostra sinais de miocardiopatia dilatada.

Descreveram-se vários distúrbios estruturais que originam uma disfunção cardíaca associados a mutações pontuais neste gene, como a miocardiopatia dilatada tipo 1R e a miocardiopatia hipertrófica tipo 11. Recentemente viu-se que alguns defeitos do septo atrial também poderiam estar relacionados com estas mutações.

No caso da cardiomiopatia dilatada estudaram-se dois casos nos quais em ambos se produz uma substituição em aminoácidos muito conservados pertencentes aos domínios que se unem aos discos Z e discos intercalados, tudo o que leva à hipótese de que a dilatação se produz por um defeito de transmissão da força contrátil nos miócitos.

As alterações de ACTC1 são responsáveis por menos de 5% das cardiomiopatias hipertróficas. Demostrou-se também a existência de várias mutações pontuais, como são:

• Mutação E101K: mudanças de carga líquida e formação de ligação eletrostática fraca na posição de união da actomiosina.

• P166A: zona de interação entre monómeros de actina.

• A333P: zona de interação actina-miosina.

A patogénese parece obedecer a um mecanismo compensatório: as proteínas mutantes atuariam como "tóxico" com um efeito dominante, diminuindo a capacidade de contração com um rendimento mecânico anormal, de modo que a hipertrofia, que costuma ser tardia, seria consequência de uma resposta normal do músculo cardíaco ao estresse.

Recentemente encontraram-se mutações de ACTC1 implicadas noutros dois processos patológicos: a miocardiopatia restritiva idiopática infantil, e o miocárdio ventricular esquerdo não compacto.

Nas actinas citoplasmáticas

O locus ACTB é muito complexo. Existem muitos pseudogenes distribuídos por todo o genoma, e a sua sequência contém seis exões que podem dar lugar a até 21 transcritos diferentes por splicing alternativo, conhecidos como actinas β. Em correspondência com esta complexidade, os seus produtos também têm localizações e fazem parte de processos muito distintos (citoesqueleto, complexo NuA4 histona-acetiltransferase, núcleo celular) e associou-se a este mecanismo uma grande quantidade de processos patológicos (carcinomas, distonia juvenil, mecanismos de infeções, malformações no sistema nervoso e invasividade de neoplasmas, entre outras). Encontrou-se uma nova forma de actina kappa, que parece substituir a actina β em processos tumorais.

Imagem de microscópio confocal na qual se revela mediante anticorpos específicos a rede cortical de actina. Tal como na distonia juvenil, observa-se uma interrupção das estruturas do citoesqueleto, neste caso produzida mediante citocalasina D.

Até ao momento puderam-se detetar três processos patológicos que se devem a uma alteração direta da sequência de um gene:

O hemangiopericitoma com translocação t(7;12)(p22;q13) é um distúrbio raro, no qual se produz uma fusão por translocação do gene ACTB com o GLI1 no cromossoma 12.

A distonia de início juvenil é uma doença degenerativa rara, com afetação sistémica do sistema nervoso central, e especialmente de áreas neocorticais e talâmicas, onde se podem apreciar um tipo de inclusões eosinofílicas em forma de bastão. Os indivíduos afetados apresentam um fenótipo com malformações na linha média, perda auditiva sensorial e distonia. Devem-se a uma mutação pontual que muda o aminoácido arginina na posição 183 por um triptófano. Isto altera a interação da actina com o sistema ADF/cofilina, que regula a dinâmica de formação do citoesqueleto neuronal.

Encontrou-se uma mutação pontual com caráter dominante que produz disfunção dos neutrófilos e infeçãos recorrentes. Parece que a mutação modifica o domínio de união com a profilina e outras proteínas reguladoras. A afinidade pela profilina neste alelo está muito reduzida.

ACTG1 é o locus que codifica a proteína da γ actina citosólica responsável pela formação de microfilamentos do citoesqueleto. Contém 6 exãos, dando lugar a 22 ARN mensageiros distintos, o que produz 4 isoformas completas, possivelmente expressas de uma forma dependente de tecido. Também tem dois promotores alternativos. Encontrou-se que as sequências traduzidas deste locus e o da β actina são mais semelhantes do que o esperado, o que sugere que pode ter existido uma sequência ancestral comum que sofreu duplicação e conversão génica.

Desde o ponto de vista patológico, associou-se a processos como a amiloidose, a retinite pigmentosa, mecanismos de infeção, doenças renais e diversas perdas auditivas congénitas.

Relacionadas com seis mutações pontuais autossómicas dominantes na sequência, encontramos diversas formas de perdas de audição, em especial a sensorineural tipo 20/26. Parece que afetam de forma específica os estereocílios das células ciliadas do órgão de Corti. A β actina é a proteína mais abundante nos tecidos humanos, mas não assim nas células ciliadas, o que explicaria a localização da patologia. Por outro lado, parece que a maior parte destas mutações afetam zonas de união com outras proteínas, em especial a actomiosina. Alguns experimentos sugerem que o mecanismo patogénico deste tipo de surdez se deve a que a actina F dos mutantes seria mais sensível do que o habitual à cofilina.

Outros mecanismos patológicos

Alguns agentes infecciosos utilizam a actina, especialmente a citoplasmática, no seu ciclo de vida. Nas bactérias existem basicamente duas formas desta utilização:

• Listeria monocytogenes, algumas espécies de Rickettsia, Shigella flexneri e outros patógenos intracelulares escapam dos vacúolos fagocíticos mediante o revestimento com uma cápsula de filamentos de actina. L. monocytogenes e S. flexneri geram a partir dos filamentos de actina uma esteira em forma de "cauda de cometa" que permite a sua mobilidade. Existem ligeiras diferenças no mecanismo molecular de polimerização da «cauda de cometa» dependendo da espécie de bactéria, e há distintas velocidades de deslocamento. Este mecanismo foi estudado em muitos ensaios in vitro, que demonstraram que não se emprega nenhuma proteína motora tipo miosina, e parece que a propulsão é adquirida pela pressão exercida pela polimerização que tem lugar perto da parede do microrganismo, que previamente se rodeou de proteínas que se ligam à actina (ABPs) próprias da célula hóspede, que na sua configuração mínima se trataria do complexo Arp2/3, proteínas Ena-VASP, cofilina, uma proteína tampão e promotores da nucleação, como o complexo da vinculina. Através destes movimentos formam protrusões que chegam às células vizinhas, infetando-as, de modo que o sistema imunológico só pode combater a infeção por meio da imunidade celular. O movimento poderá ser devido à modificação da curvatura e desramificação dos filamentos. Outras espécies, como Mycobacterium marinum e Burkholderia pseudomallei, também têm a capacidade de polimerizar localmente a actina celular para facilitar o seu deslocamento mediante um mecanismo que se baseia no complexo Arp2/3; e além disso, o vírus vacínico ou Vaccinia virus também emprega elementos do citoesqueleto de actina para a sua disseminação.
• Pseudomonas aeruginosa pode formar um biofilme protetor com o qual escapa das defesas do organismo, em especial dos neutrófilos e dos antibióticos, empregando ADN e filamentos de actina do hóspede.

Além do exemplo citado anteriormente, nas etapas iniciais da internalização de alguns vírus, notavelmente o VIH, estimula-se a polimerização da actina, por exemplo inativando a cofilina.

Nos processos de invasão das células cancerosas, as protrusões baseadas em actina desempenham um papel ainda não determinado.

Evolução

O citoesqueleto eucariota tem alguns componentes que apresentam uma grande semelhança ao longo da escala filogenética, especialmente a actina e a tubulina. Por exemplo, a proteína codificada pelo gene ACTG2 de humanos possui uma equivalência absoluta com os ortólogos presentes em rata e rato, embora a nível de nucleótidos a identidade diminua para 92 %. Contudo, existem maiores diferenças com os equivalentes em procariotas (FtsZ e MreB), que, por sua vez, apresentam uma identidade de sequência de entre 40 a 50% entre as distintas espécies de bactérias e arqueias. Alguns autores sugerem que a proteína ancestral que deu origem ao modelo básico de actina eucariota se assemelha às do citoesqueleto bacteriano presentes na atualidade.

Estrutura de MreB, uma proteína bacteriana com uma estrutura tridimensional que se assemelha à da actina G.

Alguns autores salientam que a actina, a tubulina e as histonas, um tipo de proteínas envolvidas na estabilização e regulação do ADN, apresentam similaridades na sua capacidade de ligar nucleótidos e no seu funcionamento baseado no aproveitamento do movimento browniano, e sugerem que todas elas poderão derivar de um antepassado comum. Portanto, os mecanismos evolutivos diversificaram a proteína ancestral nas variantes hoje presentes, conservando, entre outras, as actinas como moléculas eficazes para abordar processos biológicos antigos e essenciais, como a endocitose.

Equivalentes em bactérias

As bactérias não têm um citoesqueleto comparável em complexidade ao dos eucariotas, mas foram descritas proteínas que têm uma grande semelhança com os monómeros e polímeros de actina. A proteína MreB de bactérias polimeriza formando filamentos delgados, não helicoidais e, mais raramente, formando estruturas helicoidais semelhantes à actina F. Além disso, a sua estrutura cristalina é muito similar à da actina G (em conformação tridimensional), e até existem equivalências entre os protofilamentos de MreB e a actina F. O citoesqueleto bacteriano também possui entre os seus componentes as proteínas FtsZ, semelhantes à tubulina. Portanto, as bactérias possuem um citoesqueleto com elementos homólogos à actina (por exemplo, MreB, ParM, e MamK), mas a sequência aminoacídica destas proteínas diverge da das presentes em células animais. Não obstante, MreB e ParM possuem uma alta similaridade estrutural com a actina eucariota. Os microfilamentos, muito dinâmicos, gerados por agregação de MreB e ParM são essenciais para a viabilidade celular e participam na morfogénese da célula, segregação do xenóforo e polaridade celular. ParM, um homólogo da actina codificado num plásmido, intervém na regulação do ADN de plasmídeos.

Aplicações

O aproveitamento da actina nos laboratórios de ciência e tecnologia deriva da sua participação como pista sobre a qual se movem motores moleculares como a miosina (tanto no músculo como fora dele), e da sua presença necessária para o funcionamento celular. Também é usada como ferramenta de diagnóstico, já que algumas variantes anómalas da actina estão relacionadas com o aparecimento de patologias.

• Nanotecnologia. Os sistemas actina-miosina atuam como motores moleculares que permitem o transporte de vesículas e organelos ao longo do citoplasma. Existem ensaios que aproveitam esta capacidade dinâmica mesmo in vitro, ou seja, em sistemas acelulares, aplicando nanotecnologia. A ideia subjacente é empregar os microfilamentos como pistas sobre as quais deslizam as proteínas motoras, transportando uma determinada carga de forma controlada e dirigida a certas localizações, onde libertariam a sua carga. Isto permitiria a montagem de nanoestruturas de forma controlada. Estas capacidades poderiam aplicar-se em chips de investigação como os lab-on-a-chip, em nanocomponentes mecânicos e em nanotransformadores de energia mecânica em elétrica.
• Controlo interno em técnicas de biologia molecular, como o western blot e a PCR em tempo real. Devido a que a função da actina é necessária para a sobrevivência celular, postulou-se que a sua quantidade está tão controlada a nível de produção celular que se pode assumir que a sua transcrição (ou seja, o grau de expressão dos seus genes) e tradução (que é a geração de proteínas) é praticamente constante, independentemente das condições experimentais. Por esta razão, nos estudos de quantificação de proteínas (western blot) e de transcritos (PCR em tempo real) costuma realizar-se, além da quantificação do gene de interesse, a de outro gene de referência, como o da mencionada actina. Dividindo a quantidade do gene de interesse pela da actina é possível obter uma quantidade relativa comparável entre diferentes ensaios, sempre e quando a expressão desta última não varie; há que salientar que a actina nem sempre apresenta a estabilidade desejada na sua expressão.
• Clínica. Alguns alelos da actina são causadores de patologias, pelo que se desenvolveram técnicas para a sua deteção. Além disso, a actina pode empregar-se como marcador indireto em patologia cirúrgica: é possível empregar variações na pauta de localização nos tecidos como marcadores de invasão de neoplasias, vasculite e outros. Também, devido à sua relação com o aparelho contrátil muscular, a atrofia provoca a diminuição dos seus níveis no músculo esquelético, pelo que pode empregar-se como marcador deste fenómeno.
• Tecnologia dos alimentos. A determinação da qualidade de alguns alimentos processados, como os enchidos (ou embutidos), passa pela quantificação do seu teor na carne. Classicamente, utilizou-se um método baseado na deteção da 3-metil-histidina em hidrolisados destes produtos, porque se trata de um composto presente na actina e na cadeia pesada da miosina F (os dois componentes maioritários do músculo). A geração no animal do composto deve-se à metilação de resíduos de histidina presentes em ambas as proteínas.

História

O prémio Nobel Szent-Györgyi, codescobridor com Brúnó Straub da actina.

A actina foi observada experimentalmente pela primeira vez em 1887 por W.D. Halliburton, que extraiu do músculo uma proteína que coagulava preparações de miosina, à qual denominou "fermento da miosina". Contudo, Halliburton não foi capaz de efetuar a sua caracterização, pelo que a descoberta da actina é atribuída a Brúnó F. Straub, que naquela época era um jovem bioquímico a trabalhar no laboratório de Albert Szent-Györgyi no Instituto de Química Médica da Universidade de Szeged, na Hungria.

Em 1942, Straub desenvolveu uma nova técnica para a extração de proteínas musculares que lhe permitia isolar quantidades substanciais de actina relativamente pura. Este é essencialmente o mesmo método que se utiliza nos laboratórios atualmente. Szent-Györgyi descrevera previamente uma forma mais viscosa de miosina, produzida por extrações lentas em músculo, como "miosina ativada", e, como a proteína de Straub produzia o efeito ativador, denominou-a actina. A viscosidade diminuía se fosse adicionado ATP à mistura de ambas as proteínas, conhecida como actomiosina. O trabalho de ambos os investigadores não pôde ser publicado nos países ocidentais devido ao ambiente bélico da Segunda Guerra Mundial, mas veio a público em 1945 ao ser publicado como suplemento na Acta Physiologica Scandinavica. Straub continuou a trabalhar na actina até 1950, publicando que podia ligar-se ao ATP e que, durante a sua polimerização para formar microfilamentos, se hidrolisava a ADP + P_i, que permanecia ligado ao microfilamento. Straub sugeriu que esta reação desempenhava um papel na contração muscular, mas isto só é verdade no caso do músculo liso e não foi verificado experimentalmente até 2001.

A sequência de aminoácidos foi completada por Elzinga e colaboradores em 1973, e a estrutura cristalográfica da actina G foi determinada em 1990 por Kabsch e colaboradores, embora se tratasse de um cocristal no qual formava um complexo com a desoxirribonuclease I, e nesse mesmo ano Holmes e colaboradores propuseram um modelo para a actina F. Este procedimento de cocristalização com diferentes proteínas foi empregado repetidamente durante os anos seguintes, até que em 2001 se conseguiu cristalizar a proteína isolada juntamente com ADP. Foi possível graças ao emprego de um conjugado de rodamina que impedia a polimerização bloqueando o aminoácido cys-374. Nesse mesmo ano ocorreu o falecimento de Christine Oriol-Audit, a investigadora que em 1977 conseguiu cristalizar pela primeira vez a actina na ausência de proteínas ligadas à actina (ABP). Os cristais eram demasiado pequenos para a tecnologia da época. Embora atualmente não exista um modelo de alta resolução da forma filamentosa, a equipa de Sawaya realizou em 2008 uma aproximação mais exata baseada em múltiplos cristais de dímeros de actina que contactam em diferentes locais. Este modelo foi refinado pelo próprio autor e por Lorenz. Outras abordagens, como o uso de criomicroscopia eletrónica ou radiação sincrotrão permitiram recentemente aumentar o nível de resolução e compreender com maior profundidade a natureza das interações e as mudanças conformacionais envolvidas na formação do filamento de actina.